他在1929年春天携妻子飞往上海，出任医学院细菌系教授。中山大学医学院开学时，只有8位老师，29个预科学生，汤飞凡所在的细菌系更是一片空白。他亲自设计课程、建立实验室，在教学之余进行研究，发表论文，开启了中国病毒学的研究。成为中国病毒学的拓荒者。1937年抗日战争爆发，打断了汤飞凡的研究计划。他报名参加〝上海救护委员会〞的医疗救护队，对伤员进行紧急救护。由于救护站离战场仅有几百米，数次险被日军炮火击中。在三个月的前线工作中，他几度出生入死，只回过两次家。上海沦陷后，汤飞凡原本准备随雷氏德研究所撤向英国，然而已担任中华民国卫生署长的颜福庆再次给汤写信，邀请他参与重建中华民国中央防疫处的工作。汤飞凡再次燃起为国效力的情怀，前往昆明担纲了中央防疫处处长的职务。
汤飞凡带领有限的人员生产出了狂犬疫苗、牛痘苗等简单的药剂。当防疫处的状况略有改善后，他把防疫处变成当时中国国内唯一的微生物研究所，生产出了符合国际标准的疫苗和血清。所制药品不仅送往全国各地的战场，还为英美盟军所用，为世界二战的胜利作出了贡献，中华民国国民政府下属的中央防疫处因此名扬海内外。抗战胜利后，汤飞凡随防疫处迁回北京旧址，重建战火后的家园。他在美国的资助下建成了占地万余平方米的中央防疫实验处总处，又凭藉一套小型青霉素制造设备，建立了中国第一个抗生素生产车间。1948年，他主持生产每支20万单位的青霉素，堪比进口产品。可以说，没有汤飞凡的努力，就没有中国病毒学的飞跃性发展。
